玉米耐鹽新機(jī)制：SnRK2-HAK模塊調(diào)控莖葉鈉離子外排的自然變異

利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制了 ZmSnRK2.10 的單基因敲除突變體 (ZmSnRK2.10^crispr-1, ZmSnRK2.10^crispr-2) 和 ZmSnRK2.9 的單基因敲除突變體 (ZmSnRK2.9^crispr-1, ZmSnRK2.9^crispr-2)，以及 ZmSnRK2.9/10 雙敲除突變體。

在100 mM NaCl鹽脅迫下，ZmSnRK2.10 單敲突變體生物量顯著低于野生型 (WT)，而 ZmSnRK2.9 單敲突變體表型與WT無差異 (Fig. 1a-c)。

ZmSnRK2.9/10 雙敲突變體對(duì)鹽脅迫極度敏感，生物量損失高達(dá)~65%，且表型比 ZmSnRK2.10 單敲更嚴(yán)重 (Fig. 1d-f)。這表明 ZmSnRK2.9 和 ZmSnRK2.10 功能冗余，但 ZmSnRK2.10 在耐鹽性中起主導(dǎo)作用。

激酶活性檢測(cè) (Fig. 1j): 利用含有MyBP底物的凝膠內(nèi)激酶實(shí)驗(yàn) (In-gel kinase assay) 發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫 (2h) 能特異性激活野生型玉米中ZmSnRK2.9和ZmSnRK2.10的激酶活性，而這種激活在雙敲突變體中消失。

•   結(jié)論： ZmSnRK2.10 (以及冗余的ZmSnRK2.9) 是玉米響應(yīng)鹽脅迫、維持生長所必需的蛋白激酶，其激酶活性在鹽脅迫下被激活。

    分析鹽脅迫 (100 mM NaCl) 下不同基因型植株（WT, ZmSnRK2.9^crispr-1, ZmSnRK2.10^crispr-1, ZmSnRK2.9/10^crispr-1）地上部(Shoot)和根部(Root)的離子含量 (Na⁺, K⁺, Cl⁻) 以及木質(zhì)部汁液 (Xylem sap) 的離子含量。與WT相比，ZmSnRK2.10^crispr-1 和 ZmSnRK2.9/10^crispr-1 在鹽脅迫下表現(xiàn)出：顯著更高的地上部Na⁺含量 (Fig. 2a)；顯著更低的根部Na⁺含量 (Fig. 2b) - 表明Na⁺更多地滯留在地上部，未能有效在根部積累或排出。顯著更低的地上部K⁺含量 (Fig. 2c) 和 顯著更高的地上部Na⁺/K⁺比 (Fig. 2e) - 破壞離子穩(wěn)態(tài)，影響生理功能。Cl⁻含量無顯著差異 (Fig. 2g, h)。

  木質(zhì)部汁液分析 (Fig. 2i-k) 顯示，ZmSnRK2.10^crispr-1 和 ZmSnRK2.9/10^crispr-1 的木質(zhì)部汁液中Na⁺含量更高、K⁺含量更低、Na⁺/K⁺比更高。這直接證明了ZmSnRK2.9/10通過減少Na⁺從根向地上部（通過木質(zhì)部）的轉(zhuǎn)運(yùn)來促進(jìn)莖葉Na⁺外排。

     結(jié)論：ZmSnRK2.9/10通過阻止根-莖Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)、維持地上部Na⁺/K⁺穩(wěn)態(tài)來增強(qiáng)玉米耐鹽性。

酵母雙雜交 (Y2H) (Fig. 3a): ZmSnRK2.9和ZmSnRK2.10特異性與ZmHAK4的N端胞內(nèi)域 (ZmHAK4ᴺ) 相互作用，不與C端或其他鈉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ZmHKT1;1, ZmHKT1;2) 的N/C端互作。

體外Pull-down (Fig. 3b, c): 純化的GST-ZmSnRK2.9/10蛋白能夠下拉MBP-ZmHAK4ᴺ蛋白。

熒光素酶互補(bǔ)成像 (LCI) (Fig. 3d): 在煙草葉片中，共表達(dá)cLUC-ZmSnRK2.9/10和nLUC-ZmHAK4ᴺ能產(chǎn)生強(qiáng)烈的發(fā)光信號(hào)，證實(shí)體內(nèi)互作。

體外磷酸化 (In vitro kinase assay) (Fig. 4a, b): 純化的MBP-ZmSnRK2.9/10蛋白能夠磷酸化GST-ZmHAK4ᴺ蛋白。將ZmHAK4ᴺ的預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)Ser5突變?yōu)楸�氨�?(S5A) 后，磷酸化水平顯著降低或消失 (尤其對(duì)ZmSnRK2.9)，證明 Ser5是關(guān)鍵的磷酸化位點(diǎn)。

鹽誘導(dǎo)磷酸化 (In-gel kinase assay) (Fig. 4c): 以GST-ZmHAK4ᴺ為底物的凝膠內(nèi)激酶實(shí)驗(yàn)顯示，鹽脅迫 (2h) 顯著增強(qiáng)了野生型植株中ZmSnRK2.9/10對(duì)ZmHAK4ᴺ的磷酸化活性，而這種增強(qiáng)在 ZmSnRK2.10^crispr-1 和 ZmSnRK2.9/10^crispr-1 突變體中顯著減弱。

結(jié)論： 鹽脅迫下，激活的ZmSnRK2.9/10激酶在質(zhì)膜定位處與ZmHAK4的N端相互作用，并磷酸化其Ser5位點(diǎn)。

在 Na⁺外排缺陷酵母中，共表達(dá) ZmHAK4 與 ZmSnRK2.9/10 可增強(qiáng)酵母 Na⁺積累和鹽敏感性，而 Ser5 突變體無此效應(yīng)，證明磷酸化 Ser5 是增強(qiáng) ZmHAK4 轉(zhuǎn)運(yùn)活性的關(guān)鍵。

結(jié)論：ZmSnRK2.9/10 通過磷酸化 Ser5 增強(qiáng) ZmHAK4 的 Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

鹽脅迫下，ZmHAK4^crispr-1 和 ZmSnRK2.10^crispr-1 單突變體生物量均顯著低于WT。雙突變體的表型與ZmSnRK2.10^crispr-1單突變體相似，并未表現(xiàn)出加性效應(yīng)。這表明ZmHAK4很可能位于ZmSnRK2.10的下游發(fā)揮作用。

結(jié)論：ZmSnRK2.10主要通過磷酸化并激活下游的Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmHAK4來調(diào)控根-莖Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)莖葉Na⁺外排和耐鹽性。

對(duì)105份玉米自然自交系進(jìn)行 ZmSnRK2.10 基因 (啟動(dòng)子、CDS、3'UTR) 測(cè)序和轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)分析 (eGWAS)。鑒定到3個(gè)完全連鎖 (r²=1) 的變異位點(diǎn)：SNP-357, SNP-467 和一個(gè) 20-bp缺失 (Del-356)，它們與 ZmSnRK2.10 轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)最顯著。ZmSnRK2.10 啟動(dòng)子的 Del-356 與低轉(zhuǎn)錄水平、高莖葉 Na⁺含量及低耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)；啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)證實(shí) Del-356 降低轉(zhuǎn)錄活性，F(xiàn)2 群體驗(yàn)證該變異的遺傳效應(yīng)。

• 結(jié)論：Del-356 是 ZmSnRK2.10 轉(zhuǎn)錄水平及耐鹽性自然變異的關(guān)鍵，不含該缺失的等位基因?yàn)閮?yōu)良耐鹽型。

該研究首次揭示了SnRK2激酶通過磷酸化轉(zhuǎn)錄后調(diào)控HAK家族Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的分子機(jī)制，解析了“SnRK2-HAK”模塊調(diào)控作物核心耐鹽生理過程（莖葉Na⁺外排）的完整通路。 鑒定出ZmSnRK2.10啟動(dòng)子關(guān)鍵變異 (Del-356) 是玉米莖葉Na⁺含量自然變異的重要遺傳基礎(chǔ)。首次揭示 SnRK2-HAK 模塊調(diào)控作物耐鹽的分子通路，鑒定的優(yōu)良等位基因?yàn)槟望}玉米分子育種提供明確靶點(diǎn)和策略。

參考文獻(xiàn)：

Zhang, M., Zhou, X., Wang, L. et al. A SnRK2-HAK regulatory module confers natural variation of salt tolerance in maize. Nat Commun 16, 4026 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59332-x

END

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